Diseño y validación de un ensayo x-MAP™ para la genotipificación simultánea de marcadores moleculares asociados con genes de farmacoresistencia en plasmodium falciparum. Perú, 2000 - 2009

Abstract

El análisis de marcadores moleculares es el medio más sencillo para monitorizar la aparición o progresión de fármaco resistencia a antimaláricos en el Perú. Para facilitar esta labor desarrollamos un sistema basado en microesferas para identificar polimorfismos de nucleótido único (SNPs) asociados con fármaco resistencia en los genes Pfdhfr, Pfdhps, Pfcrt y Pfmdr-1 de P. falciparum. Logramos diseñar un completo método de vigilancia molecular por minisecuenciamiento multiplex basado en la extensión específica de alelo (x-MAP ASPE). Partimos de amplificaciones de PCR de las secuencias blanco para generar productos fluorescentes marcados usando oligonucleótidos que contienen una secuencia específica de captura de SNPs y una mezcla de reacción de PCR que contiene ddCTP marcado con biotina. Luego de marcadas, las amplificaciones específicas de alelo fueron capturadas utilizando microesferas fluorescentes seguido por incubación con estreptavidina-R-ficoeritrina, y analizadas en el citómetro Bio-Plex™. Por lo tanto, utilizando 44 oligonucleótidos alelo-específicos y 44 microesferas el procedimiento identificó correctamente a 21 polimorfismos en los cuatro genes individualmente en reacciones específicas de gen o en una sola reacción multiplex. Al analizar aislamientos caracterizados por secuenciamiento, nuestros resultados obtenidos con estrategia x-MAP ASPE fueron concordantes según lo muestran las curvas ROC para los 11 alelos polimórficos encontrados, la sensibilidad y especificidad del ensayo fueron superiores al 80%; el punto de corte del radio alélico para los alelos mutantes fue 0.2 a 0.28. La prevalencia de SNPs influencio en el resultado final, por lo que se requiere de evaluación adicional para determinar su aplicación en zonas de transmisión de la malaria bajo tales como las existentes en el Perú.