Modelamiento in vitro por CRISPR/Cas9 de una mutación VUS encontrada en pacientes peruanas diagnosticadas con cáncer de mama hereditario

Abstract

El cáncer de mama es la neoplasia más común diagnosticada en mujeres alrededor del mundo y el segundo tipo de cáncer más frecuente en Perú. Hasta un 10% de casos son hereditarios, donde la mayoría corresponde a mutaciones en los genes supresores de tumor BRCA1 y BRCA2. De dichas mutaciones, aproximadamente el 50% generan “Variantes Genéticas de Significado Indeterminado” (Variants of Uncertain Significance, VUS). Recientemente, hemos reportado la identificación de seis nuevas VUS encontradas en familias peruanas con historia de cáncer hereditario, de las cuales, la variante c.5074+28T>A fue detectada en 07 familias. El objetivo de este estudio fue modelar dicha VUS en una línea celular de tejido mamario sano (SVCT) mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Con este fin, las células SVCT fueron transfectadas por electroporación con los complejos de ARN guía y la enzima Cas9. Dicha transfección fue comprobada por citometría de flujo, el ensayo con la enzima T7EI y secuenciación Sanger. Como resultado, se obtuvieron clones (single-cell) por dilución limitante. El ADN de dichos clones fue evaluado por PCR y digestión enzimática. Los clones positivos fueron seleccionados y analizados por secuenciación Sanger, donde se identificó 01 clon portador de la VUS c.5074+28T>A. Asimismo, se modeló la variante patogénica c.5074+1G>A para usarla como control positivo en futuros estudios. De esta última variante, se obtuvieron 02 clones positivos en heterocigosis. Los resultados obtenidos sirven como prueba concepto para desarrollar una plataforma de modelado con CRISPR/Cas9 y el estudio de VUS de pacientes peruanas con cáncer de mama u otras enfermedades.